Селективные маркеры плазмидных векторов

На каком этапе молекулярного клонирования требуется применить отбор, селекцию? Конструирование плазмиды происходит в пробирке. Как мы выяснили ранее, для получения с ДНК белкового продукта плазмида должна быть введена в живые клетки. Если просто смешать в пробирке клетки и препарат плазмидной ДНК, ничего не произойдет. Клетки будут плавать в растворе сами по себе, а плазмиды – сами по себе, отдельно от клеток. Существует два основных способа заставить клетки поглощать плазмидную ДНК.

Первый способ — электропорация. Раствор плазмидной ДНК и клеток можно кратковременно подвергнуть воздействию электрического поля. Электрическое поле меняет свойства клеточной поверхности так, что она становится проницаемой для веществ, содержащихся во внеклеточной среде. Таким образом, плазмидная ДНК может проникнуть внутрь клеток.

Второй способ — тепловой шок. Экспериментально показано, что плазмида также может проникнуть внутрь клеток, если заранее обработать клетки ионами кальция (Ca2+) в специальных условиях (эта процедура делает клетки компетентными), а затем в течение короткого время (1 мин) прогревать (t=42°с) раствор, содержащий такие клетки и плазмидную ДНК. Собственно поглощение плазмиды клетками происходит при повышеннии температуры - тепловом шоке, когда обработанные кальцием мембраны меняют свои свойства и становятся более проницаемыми.

Вообще процесс поглощения клетками содержащейся во внеклеточной среде ДНК (при условии дальнейшего стабильного существования этой молекулы в клетке и реализации ее генетической информации) называется трансформацией. Первоначально трансформация была открыта в дикой природе, и лишь затем ученые научились реализовывать этот процесс в экспериментах.

Все клетки популяции никогда не могут быть трансформированы одновременно. Трансформация всегда происходит с некой эффективностью. Чтобы отобрать клетки, которые поглотили ДНК, все клетки после трансформации высевают на селективную среду. Селективная среда - это питательная среда, которая содержит какой-то фактор селекции, отбора. Обычно в роли такого фактора выступает антибиотик. Если сконструированная плазмида содержит группу генов, продукты которых ограждают клетку от токсического действия какого-либо антибиотика (выбрасывают антибиотик из клетки, разрушают его, связывают его в нетоксичную форму), то клетка, поглотившая такую плазмиду, выживет на селективной среде с добавлением этого антибиотика.

Если оставить чашки с селективной средой, на которые были высеяны бактерии после трансформации, расти на несколько часов, то через несколько часов на поверхности чашки появятся видимые глазом колонии. Каждая такая колония образовалась из одной-единственной клетки. Поскольку среда содержит антибиотик, а колония все равно вырастает, можно сделать вывод о том, что клетки данной колонии были трансформированы плазмидой.

Таким образом, если сконструировать in vitro плазмиду, которая содержит не только генно-инженерную последовательность ДНК, но также гены, защищающие клетку от действия определенного антибиотика, то вырастание колонии на чашке с питательной средой с добавлением этого антибиотика будет свидетельствовать также о наличии генно-инженерной последовательности в выросших клетках. Ну, а дальше предоставляем возможность бактериям синтезировать нужный нам продукт и выделяем его из клеток.

Из бактериальных клеток в промышленных масштабах получают, например, гормон роста человека и гормон инсулин.