Представим, что перед молекулярным биологом стоит такая задача:

1. Из фрагментов ДНК А, B и F выделить фрагменты a, b и f, соответственно;
2. Сшить a, b и f с образованием молекулы a+b+f;
3. Изучить свойства белкового продукта сконструированной молекулы.

Выделить a, b и f из A, B и F можно с помощью рестрикции или ПЦР. Сшить выделенные фрагменты ДНК можно в ходе реакции лигирования. Но как получить с молекулы, сконструированной in vitro, белковый продукт? Рассмотрим все варианты.

Во-первых, существуют бесклеточные системы сопряженной транскрипции-трансляции. Такие реакции протекают в пробирке, вне клетки; для их осуществления необходимо добавить в пробирку не только нуклеотиды (для построения цепи РНК на матрице ДНК) и аминокислоты (для построения белковой молекулы на матрице иРНК), не только разнообразные кофакторы (например, Mg2+), но также комплекс ферментов, синтезирующих РНК, и клеточные органеллы рибосомы, на которых в клетке идет синтез белка. Необходимо также предусмотреть, будет ли белок, синтезированный в такой системе, сворачиваться правильно, ведь в клетке этот процесс протекает с участием разнообразных комплексов ферментов (для разных белков) и различных органелл. Например, в лизосомах может отщепляться тот фрагмент белковой молекулы, который был необходим лишь для правильного синтеза молекулы, но не принимает участия в выполнении функций зрелого белка. Итак, для получения белка в системе бесклеточной транскрипции-трансляции требуется организовать одновременное протекание множества ферментативных реакций на одной территории. Понятно, что это осуществимо только для простых случаев, но и тогда требуется значительное количество усилий для того, чтобы отрегулировать систему. К тому же, эта система совершенно непригодна для получения белков (например, белковых гормонов) в промышленных масштабах.

Во-вторых, можно перевести последовательность нуклеотидов полученной ДНК-матрицы в последовательность аминокислот, используя таблицу генетического кода, и синтезировать белковую молекулу химическим путем. Для этого потребуется сначала правильно определить единственную рамку считывания из 6 возможных вариантов на одной и той же молекуле ДНК. К тому же, чрезвычайно дорогим, длительным и сложным является химический синтез белковой молекулы.

Ну, и наконец, можно предоставить возможность думать обо всех аспектах синтеза самой клетке. Да и что может быть проще и элегантнее этого решения?! Позаботимся о том, чтобы клетка росла при оптимальных для нее температурных условиях и о том, чтобы в окружающей клетку среде содержались все необходимые исходные вещества, и пусть сама организует каждую реакцию, каждый этап синтеза, заботится о том, чтобы доставить нужное количество компонентов на место реакции и о том, чтобы обеспечить одновременное протекание многих реакций на маленькой территории. А уж о том, как выделить синтезированный белковый продукт из клетки-работяги, ученый позаботится.

Сразу оговоримся. Значительно проще «договориться» с системой прокариотической.

Во-первых, прокариоты гораздо быстрее растут и чаще делятся. Так, длительность клеточного цикла (промежуток времени от одного деления до другого) у клеток человека составляет около суток, а у клеток бактерии E.coli – всего 20 минут. Понятно, что чем больше клеток будет вовлечено в синтез интересующего нас продукта, тем больше этого продукта мы получим.

Во-вторых, прокариоты в целом устроены проще, а значит, меньше вероятность, что вмешательство ученых нарушит процессы их жизнедеятельности.

Но ведь клетка синтезирует множество белков! Она синтезирует множество белков для реализации собственных потребностей! Как можно заставить клетку синтезировать нужный нам продукт, да еще с искусственно созданной молекулы?

Для начала, необходимо снабдить клетку ДНК-матрицей для синтеза нашего белкового продукта. Однако, если ввести синтезированный in vitro фрагмент ДНК в клетки бактерий, он быстро разрушится защитной системой клетки-хозяина, как чужеродный. Значит, необходимо, чтобы наш фрагмент ДНК выглядел для бактерии как «свой». Логично предположить, что он будет казаться бактерии «своим», если войдет в состав генома. Можно снабдить наш фрагмент специальными последовательностями, способствующими интеграции в геном. Но это сложно, к тому же, всегда есть вероятность, что встроившись в геном, наша последовательность ДНК «выключит» какой-то важный для жизнедеятельности бактерии ген.

Что же делать?

Исследователи тоже долгое время не могли придумать ничего хорошего. Но потом стали известны новые факты о жизни бактерий, и ученые быстро смекнули, как могут применить эти сведения на практике. Речь идет об открытии бактериальных плазмид. На настоящий момент о плазмидах известно очень многое.

Небольшой молекулой плазмидной ДНК манипулировать гораздо проще, чем огромным бактериальным нуклеоидом. Плазмидную ДНК можно выделить из клеток отдельно от всех других компонентов. В любой плазмидной ДНК найдутся сайты рестрикции, по которым удобно вставлять сконструированный отдельно фрагмент ДНК. Применяя плазмиды, которые не встраиваются в геном бактерии, можно не опасаться изменения состава и строения бактериального генома. Наконец, используя плазмиды, содержащие селективный маркер, можно отбирать только те популяции бактерий, которые содержат сконструированный фрагмент ДНК. Остановимся на этом подробнее.