ПЦР

(Полимеразная Цепная Реакция, Polymerase Chain Reaction)

Введение в повсеместную лабораторную практику ПЦР сделало революцию в мире науки. ПЦР — это метод, позволяющий за короткое время из очень небольшого количества исходных ДНК-молекул синтезировать большое количество точно таких же молекул ДНК, причем специфичность реакции очень высока.

Рассмотрим механизм реакции.

Схема ПЦР

ПЦР состоит из множества однотипных циклов. Каждый цикл состоит из трех шагов.

На первом шаге происходит денатурация ДНК, т.е. процесс, в ходе которого разрываются комплементарные связи между нуклеотидами, в результате чего две цепи молекулы ДНК отделяются друг от друга. Денатурация происходит в результате нагревания раствора, содержащего ДНК, до 92-95°с.

На втором шаге температура реакционной смеси понижается до 50-65°с. При этой температуре праймеры, также находящиеся в реакционной смеси, комплементарно связываются с ДНК-матрицей — происходит отжиг праймеров.

На третьем шаге температура смеси повышается до 72°с. При этой температуре происходит достройка цепи особой термоустойчивой полимеразой. (Термоустойчивые полимеразы были впервые выделены из бактерий, живущих в горячих источниках.) Синтез происходит в соответствии с общей схемой ДНК-полимеразной реакции. В роли затравки выступает праймер, в роли матрицы — цепь ДНК, на которой праймер «отжегся».

Из рисунка видно, что в результате одного цикла число молекул ДНК в реакционной смеси увеличивается в 2 раза. Число молекул ДНК увеличивается в 2 раза на каждом из циклов. Таким образом, число молекул ДНК в ходе всей реакции ПЦР увеличивается в 2n раз, где n — число циклов реакции. Это колоссальное увеличение! Быстрое увеличение числа копий ДНК напоминает о таком изобретения человека, как копировальный аппарат:

ПЦР как ксерокс

Однако через некоторое время продуктивность системы все-таки падает, так что на графике зависимости количества синтезируемых фрагментов ДНК от номера цикла можно наблюдать выход на плато:

Выход на плато

Причин этого явления несколько. Среди основных — истощение субстратов реакции и падении реакционной активности полимеразы.

Таким образом, количество фрагментов ДНК, синтезируемых в ходе ПЦР, увеличивается экспоненциально.

Давайте вместе зададимся вопросом: почему при высокой температуре происходит денатурация ДНК? Ответ прост. При повышении температуры в системе увеличивается количество свободной энергии, что приводит к разрыву водородных связей между комплементарными друг другу основаниями. Состояние, в котором все комплементарные связи разрушены, соответствует состоянию полной денатурации молекулы.

Любая молекула ДНК при повышении температуры претерпевает ряд последовательных изменений. Проследим эти изменения на кривой плавления ДНК.

Кривая плавления ДНК

При нагревании ДНК не сразу денатурирует полностью. ДНК сохраняет двуцепочечную структуру при нагревании до значительной высоких температур. Затем начинают денатурировать (плавиться) отдельные участки молекулы: те, в которых больше содержание низкоэнергетических пар А-Т. С увеличением свободной энергии системы увеличивается и число расплавленных участков. Наступает момент, когда ровно половина ДНК находится в расплавленном состоянии. Температура, при которой реализуется это состояние, для каждой молекулы ДНК своя. Такая температура называется температурой плавления (Melting Temperature) и является индивидуальной характеристикой данной конкретной молекулы ДНК. Вскоре ДНК плавится полностью.

Если измерять поглощение раствора ДНК при длине волны 260 нм (при этой длине волны поглощают основания, входящие в состав ДНК) при нагревании, то можно получить следующие результаты. Вплоть до температуры около 70°с поглощение будет постоянным — ~1. Затем значения поглощения будут быстро расти в относительной небольшом интервале температур, пока снова не выйдут на плато. Величина температурного интервала от начала подъема S-образной кривой до его окончания также является индивидуальной характеристикой молекулы и обозначается ΔТ.

Денатурированная молекула ДНК при обратном понижении температуры может ренатурировать:

Денатурация и Ренатурация ДНК

Приведу несколько фактов о ренатурации, которые вам нужно знать сейчас:

  1. Гибридизация специфична. Гибридизуются молекулы, обладающие комплементарностью. Некомплементарные молекулы не гибридизуются.
  2. Гибридизация комплементарных молекул происходит даже в сложных смесях нуклеиновых кислот.
Назад
Хостинг от uCoz