ПЦР(Полимеразная Цепная Реакция, Polymerase Chain Reaction) |
||
Введение в повсеместную лабораторную практику ПЦР сделало революцию в мире науки. ПЦР это метод, позволяющий за короткое время из очень небольшого количества исходных ДНК-молекул синтезировать большое количество точно таких же молекул ДНК, причем специфичность реакции очень высока. Рассмотрим механизм реакции.
![]() ПЦР состоит из множества однотипных циклов. Каждый цикл состоит из трех шагов. На первом шаге происходит денатурация ДНК, т.е. процесс, в ходе которого разрываются комплементарные связи между нуклеотидами, в результате чего две цепи молекулы ДНК отделяются друг от друга. Денатурация происходит в результате нагревания раствора, содержащего ДНК, до 92-95°с. На втором шаге температура реакционной смеси понижается до 50-65°с. При этой температуре праймеры, также находящиеся в реакционной смеси, комплементарно связываются с ДНК-матрицей происходит отжиг праймеров. На третьем шаге температура смеси повышается до 72°с. При этой температуре происходит достройка цепи особой термоустойчивой полимеразой. (Термоустойчивые полимеразы были впервые выделены из бактерий, живущих в горячих источниках.) Синтез происходит в соответствии с общей схемой ДНК-полимеразной реакции. В роли затравки выступает праймер, в роли матрицы цепь ДНК, на которой праймер «отжегся». Из рисунка видно, что в результате одного цикла число молекул ДНК в реакционной смеси увеличивается в 2 раза. Число молекул ДНК увеличивается в 2 раза на каждом из циклов. Таким образом, число молекул ДНК в ходе всей реакции ПЦР увеличивается в 2n раз, где n число циклов реакции. Это колоссальное увеличение! Быстрое увеличение числа копий ДНК напоминает о таком изобретения человека, как копировальный аппарат:
![]() Однако через некоторое время продуктивность системы все-таки падает, так что на графике зависимости количества синтезируемых фрагментов ДНК от номера цикла можно наблюдать выход на плато:
![]() Причин этого явления несколько. Среди основных истощение субстратов реакции и падении реакционной активности полимеразы. Таким образом, количество фрагментов ДНК, синтезируемых в ходе ПЦР, увеличивается экспоненциально. Давайте вместе зададимся вопросом: почему при высокой температуре происходит денатурация ДНК? Ответ прост. При повышении температуры в системе увеличивается количество свободной энергии, что приводит к разрыву водородных связей между комплементарными друг другу основаниями. Состояние, в котором все комплементарные связи разрушены, соответствует состоянию полной денатурации молекулы. Любая молекула ДНК при повышении температуры претерпевает ряд последовательных изменений. Проследим эти изменения на кривой плавления ДНК.
![]() При нагревании ДНК не сразу денатурирует полностью. ДНК сохраняет двуцепочечную структуру при нагревании до значительной высоких температур. Затем начинают денатурировать (плавиться) отдельные участки молекулы: те, в которых больше содержание низкоэнергетических пар А-Т. С увеличением свободной энергии системы увеличивается и число расплавленных участков. Наступает момент, когда ровно половина ДНК находится в расплавленном состоянии. Температура, при которой реализуется это состояние, для каждой молекулы ДНК своя. Такая температура называется температурой плавления (Melting Temperature) и является индивидуальной характеристикой данной конкретной молекулы ДНК. Вскоре ДНК плавится полностью. Если измерять поглощение раствора ДНК при длине волны 260 нм (при этой длине волны поглощают основания, входящие в состав ДНК) при нагревании, то можно получить следующие результаты. Вплоть до температуры около 70°с поглощение будет постоянным ~1. Затем значения поглощения будут быстро расти в относительной небольшом интервале температур, пока снова не выйдут на плато. Величина температурного интервала от начала подъема S-образной кривой до его окончания также является индивидуальной характеристикой молекулы и обозначается ΔТ. Денатурированная молекула ДНК при обратном понижении температуры может ренатурировать:
![]() Приведу несколько фактов о ренатурации, которые вам нужно знать сейчас:
|
||
Назад |