Выделение геномной ДНК
- Лизис клеток и клеточных мембран.
Клетки разрушают механически или с помощью ферментативной обработки. Мембраны разрушают обработкой детергентами (навпример, SDS) или хаотропными агентами (гуанидин изотиацианат).
- Удаление белков (депротеинизация).
Белки экстрагируют смесью фенола, хлороформа, изоамилового спирта. Поскольку плотности этих органических растворитлей отличны от плотности воды, при центрифугировании лизата клеток, к которому были добавлены фенол и хлороформ, образуется два отдельных слоя: нижний, представляющий собой раствор на основе органических растворителей, и верхний, содержащий водный раствор. При этом белки денатурируют и образуют преципитат, который располагается узкой полосой на границе водной и органической фаз. Если фенол был уравновешени буфером с нейтральным значением рН, то водная фаза будет содержать сразу и ДНК, и РНК.
Если же фенол был уравновешен буфером, имеющим кислое значение рН, то ДНК окажется в нижнем, органическом слое, а РНК - в верхнем, водном.
- Получение концентрированной фракции нуклеиновых кислот.
Используют осаждение ДНК этанолом (изопрапанолом) в присутствии соли (ацетата натрия) с дальнейшим отделением осадка центрифугированием и растворением осадка или адсорбцию ДНК на твердом носителе (например, стекло) с дальнейшей элюцией.
Выделение плазмидной ДНК
Для выделения плазмидной ДНК из клеток используют щелочной метод. В ходе эксперимента изменяют pH раствора, содержащего геномную и плазмидную ДНК, на щелочной. При таком значении pH вся ДНК денатурирует. Однако цепи двуцепочечной плазмидной ДНК при этом остаются связанными друг с другом, поскольку плазмиды имеют кольцевую форму. При дальнейшей ренатурации, которая инициируется изменением pH раствора до первоначального, длинные цепи геномной ДНК, успев разойтись в растворе при денатурации, образуют плотный неструктурированный комок, а цепи плазмидной ДНК успешно восстанавливают исходную структуру. Теперь плазмидную ДНК легко отделить от геномной ДНК в ходе центрифугирования.
